基于GEO数据库芯片对反复种植失败者子宫内膜生物信息学分析及讨论。从我国前六次全国人口普查分析，我国人口出生率总体呈下降趋势，人口总体生育能力的下降是一个不可忽视的问题。对于女性，妊娠的成败关键在于胚胎能否成功植入子宫并顺利生长。随着人们生育观念的改变、三孩政策的放开、晚婚晚育的普遍，高龄妇女逐渐在女性生育大军中占据较高比例，这类女性生育能力显然下降，辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)的发展无疑为这类难以自然受孕女性带来生育的希望。

胚胎很好内膜很好为什么会移植失败

体外受精/卵胞质内单精子注射-胚胎移植(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，IVF/ICSI-ET)是用人工方法让卵子和精子在IVF并进行早期胚胎发育，然后移植到母体子宫内发育而诞生的婴儿。该技术的发展帮助广大不孕不育患者解决大部分生育困扰，但随之而来的反复种植失败及妊娠丢失无疑是此技术发展中需面临的问题，其中以反复种植失败问题尤为突出。健康的胚胎及容受性良好的子宫内膜能大大提高种植率，有研究显示，约2/3的着床失败与子宫内膜容受性相关[1]，子宫内膜容受性即子宫内膜允许胚胎黏附直至完成植入过程。

本研究以着床窗口期子宫内膜为研究组织出发，借助GEO数据库探讨其关键基因及信号通路，从基因表达层面分析差异表达基因对胚胎植入过程的影响。下面让我们和艾尼亚健康试管试管之家专家一起来了解一下基于GEO数据库芯片对反复种植失败者子宫内膜生物信息学分析的讨论情况。

内膜很好就是移植不成功

ART的成功涉及多方面的因素，任何一个环节异常，均有可能导致胚胎着床失败。RIF指女性至少经历连续3次IVF，且每次均有1~2个优质胚胎移植或多次移植总胚胎数≥10枚仍未获临床妊娠。目前RIF的病因未明，一般认为可能与子宫内膜容受性降低、胚胎遗传或发育异常、移植技术、免疫因素有关，而其中子宫内膜容受性损害是关键原因。但子宫内膜容受性受多种因素调控，目前对该方面的研究仍较局限，近年来不少研究从蛋白及基因表达水平方面入手探究疾病发生分子机制，对探讨影响子宫内膜容受性原因，阐明RIF分子机制的研究提供新的线索。

着床过程的分子调控机制是十分复杂的，其中包括调控胚胎和子宫内膜合成分泌的过程，调控胚胎和子宫内膜的同步发育和相互识别的过程，调控子宫内膜容受性的形成过程，调控胚胎滋养层对子宫内膜的侵入过程，调控母-胎界面免疫耐受过程等，这些不同的环节涉及到各种非激素类分子，包括转录因子、细胞因子、生长因子、黏附分子、蛋白酶及其抑制物等。

本研究采用生物信息学分析方法研究GSE26787数据集及GSE111974数据集，得出RIF及正常对照组织中的共同差异表达基因共74个，通过GO功能分析差异基因富集于蛋白细胞外基质、细胞器膜、膜的组成部分区域，涉及的生物过程包括氧化还原过程、老化、轴突生成、单细胞黏附、黄嘌呤分解代谢过程，富集的分子功能包括黄素腺嘌呤二核苷酸结合、黄嘌呤脱氢酶活性，KEGG通路为代谢途径，其中黄嘌呤分解代谢、黄素腺嘌呤二核苷酸结合、黄嘌呤脱氢酶活性均涉及细胞氧化还原，上述富集分析结果体现了该段时期子宫内膜氧化还原过程的重要性。

氧化还原反应是生物体内普遍存在且十分重要的生物化学反应，细胞的氧化还原状态发生改变时，对细胞膜内外发生氧化或还原作用，引起结构和构象改变，发挥调控细胞信号转导、基因转录等重要作用。细胞的氧化还原稳态与细胞功能关联，细胞的整体氧化还原环境决定细胞的生物状态和功能，如增殖、分化、死亡等。

一般认为，相对于氧化还原当量，过量的活性氧被定义为氧化应激，相反抗氧化剂的过度积累被定义为还原应激，两者均可对细胞组织造成损伤。氧化应激的结果取决于细胞的类型和氧化应激的严重程度，主要包括增殖增加、防御上调、细胞损伤、细胞死亡;而长时间氧剥夺和化学缺氧可引起还原应激，破坏细胞的能量供应和还原当量水平，影响了细胞内的其他氧化还原系统，还原应激会导致改变信号转导、改变基因激活、离子失衡、线粒体功能障碍、增强降解，相关的有害结局是导致细胞死亡。

有研究表明，IVF过程中由于配子和胚胎暴露在外部环境下，内源性和外源性高水平的活性氧能够引起许多分子的损伤，导致细胞停止生长和早期胚胎死亡，故在体外培养的试验过程中，经常通过添加抗氧化剂来增加抗氧化能力，然而过多的抗氧化剂会扰乱了活性氧信号转导功能而增加额外的有害作用，可见氧化/还原应激对胚胎的发育会有一定的影响。且氧化活性物质增加可对不饱和脂肪酸等脂质造成损伤，有研究表明脂质过氧化和氧化应激可降低血管生成，抑制滋养细胞侵袭，引起内皮功能障碍，并诱发急性动脉粥样硬化，与流产等不良妊娠结局有关。

此外，子宫内膜自然杀伤细胞又称子宫内膜NK(uterine NK，uNK)细胞可促进母体子宫内膜血管的重塑、血管管腔扩张、新血管的生成及滋养细胞向内膜侵入，在胚胎移植和生长发育中发挥重要作用，但uNK细胞同样也有细胞杀伤作用，主要与其浓度有关，有研究显示缺氧与其他因素如转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGFβ1)等可将外周血NK细胞转化为具有uNK细胞特征的细胞，从而增强子宫内膜的免疫情况，抑制细胞的识别与胚胎的植入。

总之，氧化/还原应激无论是对胚胎发育还是子宫内膜的着床准备均有一定的损害性，现有关于子宫内膜氧化/还原应激的研究相对匮乏，在子宫内膜种植窗口期必然存在稳定的氧化还原过程保证胚胎的顺利植入及发育，而母体的差异性是否影响该时期氧化还原过程及种植胚胎本身氧化还原反应是否会引起子宫内膜相应氧化还原失衡等因素导致RIF及调控该过程的相关分子基础的探讨，需要后续进一步研究加以证明。

运用String数据库进一步分析差异基因并使用Cytoscape-cytohubba插件筛选前10位与RIF相关的关键基因中，PTGS2是前列腺素类生物合成途径中的双重环氧合酶和过氧化物酶，除了在炎症反应中起特殊作用外，还与细胞黏附增加、表型改变、抗凋亡和肿瘤血管生成有关;VCAM1在细胞-细胞识别中很重要，介导黏附和信号转导，VCAM1/ITGA4/ITGB1相互作用可在免疫应答和白细胞向炎症部位迁移中发挥病理生理作用。

MGP是维生素K依赖性蛋白，主要分布于软骨、骨髓和动脉壁，能影响钙的吸收，抑制钙磷的沉积，子宫内膜异位症患者体内可存在钙磷代谢紊乱，究其原因大多数研究认为与低雌激素有关，而两者相关性有待进一步探讨。ALPL属于碱性磷酸酶家族，是在许多生物体中都普遍存在的一种磷酸酶，可以催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，生成无机磷酸和相应的醇、酚、糖等，包括至少四种亚型(胎盘型、小肠型、肝型和骨型等)，可预知肝脏与骨骼的某些疾病，与细胞代谢有着一定的相关性;过氧化氢(H2O2)是一种重要的氧化剂，已知活性氧是细胞关键信号分子，H2O2作为第二信使也参与多种生理和病理过程，有研究显示胚胎有丝分裂和分化过程中和H2O2的传递有关，而和H2O2有关的激酶和磷酸酶同样在信号转导中也发挥重要的作用。

另有几种酶系统在特定的细胞及细胞房室中也产生H2O2，例如：环氧合酶和脂氧合酶、黄嘌呤氧化酶、D-氨基酸氧化酶、细胞色素P450等，而CYP3A5即是细胞色素P450家族中的一员。虽然关于子宫内膜容受性的影响上述基因的作用尚缺乏一定的报道，此无疑也可作为一种新的研究思路。

LPAR3是多种细胞活性的中介物，与G蛋白交合，而G蛋白是一类含有鸟苷酸的蛋白质，普遍存在于细胞外膜内表面，为生物信息转导过程中关键的中介体;G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，GPCR)是跨细胞膜传递信号转导并介导人体生理所需大量细胞反应的跨膜受体;G蛋白活化后与腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)和磷脂酶C(phospholipasec C，PLC)等效应分子作用，产生环磷酸腺苷(adenosine cyclophosphate，cAMP)、环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)、二酰甘油(diacylglycerol，DAG)、三磷酸肌醇(inositol trisphosphate，IP3)和Ca2+等细胞内第二信使，将细胞外信号再作用于靶分子;腺苷酸环化酶可催化ATP生成cAMP，cAMP与依赖cAMP的蛋白激酶(potein kinases，PKA)的调节亚基结合，活化催化亚基，催化亚基通过丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，最终对代谢及基因表达起调节作用。

溶质转运蛋白(solute carrier，SLC)是细胞内最大的一类转运蛋白，也是细胞膜上仅次于GPCR超家族的第二大类细胞膜蛋白，SLC1A1属于SLC家族中的一种，是第一家族的第一位成员，也叫作兴奋性氨基酸转运体3(excitatory amino acid transporter 3，EAAT3)或者EAAC1(excitatory amino acid carrier 1)，可介导L-谷氨酸和L-天冬氨酸和D-天冬氨酸的吸收，表达在肾脏、上皮组织、大脑和眼睛等。有研究显示SLC1A1是参与促进γ氨基丁酸、谷胱甘肽的生物合成，而谷胱甘肽是常用的还原剂，在大鼠模型中SLC1A1 mRNA在肌肉损伤后存在表达差异。而至今为止，尚未发现SLC1A1的生殖系突变具有的功能特征。

提到SLC4A7，不得不提起由SLC4A7基因编码的一种非生电型的钠离子/碳酸氢根离子共转运体(Na+/bicarbonate cotransporter electroneutral one，NBCn1)，作为一种电中型的转运体，可维持胞内HCO3-浓度的能力，使细胞得以第一时间保护自己免受酸碱紊乱的伤害，谢张东研究显示NBCn1作为一种潜在的HCO3-转运蛋白很可能参与了子宫腔HCO3-周期性地增加和减少的过程，而SLC4A7对于维持着床期宫腔环境pH值的作用仍有待进一步研究。

KISS1/GPR54通路是调节促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)分泌的重要通路，KISS1/GPR54信号传入神经细胞内将激活PLCB1基因编码的PLCβ1蛋白，后者将磷脂酰肌醇水解为第二信使DAG、IP3发挥信号传递、促进GnRH以及黄体生成素(luteinizing hormone，LH)分泌的功能。有研究表明，下调PLCβ1会损害GnRH生成、下调LH分泌。

SULT1E1是雌激素稳态的关键酶，雌激素的硫酸化导致其失活，雌激素对于内膜的作用毋庸置疑，陈海啸等通过对比促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a)的各种研究成果，总结得出GnRH-a可通过抑制炎症因子、抑制免疫因子、抑制内源性LH峰、调节内膜胞饮突的形成、内膜整合素的表达水平等途径，改善子宫内膜的容受性，并通过回顾性分析研究得出GnRH-a降调节联合激素替代治疗(hormone replacement therapy，HRT)相对于HRT能够显著提高冷冻胚胎复苏移植的妊娠率和活产率。该两种基因主要通过影响激素的分泌通路，进而改变子宫内膜的容受性。

通过MCODE得出的关键模块节点基因包括PLCB1、EDNRB、LPAR3，LPAR3与G蛋白交合，EDNRB属于G蛋白偶联受体家族，与G蛋白结合来激活磷脂酰肌醇-钙第二信使系统，PLCB1作为磷脂酰肌醇中的一员，三者共同作用，是外界信号分子转变为调节细胞内反应的基本路径。将该模块进行富集分析，所得富集通路为癌症通路(hsa05200：Pathways in cancer)，由于三者基因共同参与细胞一般信号的转导，而该通路其中必然涉及基本信号传递路径，故此模块在此分析不具意义。

上述研究结果显示，关键基因及关键信号通路与细胞代谢的一般过程、生物氧化还原等有关，且KEGG富集显著的通路为代谢途径，可见代谢途径为子宫内膜着床窗口期一类重要的生物反应，通过上述反应调控子宫内膜细胞如增殖、凋亡、代谢、血管功能调控及免疫调节等方面。

综上，胚胎着床极其复杂，任何步骤出现问题均可导致最终着床失败。本研究通过生物信息学的方法分析GEO数据库中的数据，筛选RIF患者子宫内膜组织的差异表达基因，对其进行GO分析和KEGG通路分析，初步了解了它们的功能和相关的信号通路，分析其对子宫内膜容受性的影响，进而影响胚胎着床及IVF的临床成功率，虽然本次研究所得大部分基因及关键通路对于子宫内膜容受性的影响尚无定论，但从氧化还原反应角度及生物代谢过程研究其分子基础，了解子宫内膜动态变化过程，可为今后的研究展开新的思路。