参考文献：本文引用自“染色体畸变对辅助生殖手术不成功的意义(Significance of chromosomal aberrations for the unsuccessful procedures of assisted reproduction)”，作者是不列颠哥伦比亚省塔拉齐斯，希腊塞萨洛尼基亚里士多德大学妇产科第一系;代表作有【精液参数异常的精液样品中催产素前蛋白和催产素受体mRNA表达改变】;【美国最高法院的裁决和妇女的生殖权利——欧洲委员会和妇产科学院(EBCOG)发布的立场声明】;【希腊北部接受植入前基因检测(PGT)患者的临床结果、社会经济地位和心理限制】。

摘要：

分析先前至少接受过三次不成功的辅助生殖手术的患者的淋巴细胞培养物是否存在细胞遗传学异常。共研究了来自12个个体(657名患者和33名健康对照组，15个正常后代)的18 0个中期。染色体畸变发生率(P<001.6)显著升高(79.0±68.1%;x±SD)与对照组(72.0±3.0%相比;P<001.6)。在患者中观察到染色体断裂，特别是在着丝粒区域，其频率也明显高于对照组(分别为18.0±65.1%和42.0±27.0%;P<001.3)。ART患者的着丝粒断裂率高(18.0±47.0 vs 26.0±12.0%，P<001.0)可能诱发减数分裂染色体异常。在61.0±21.0%的ART患者淋巴细胞中显示出单细胞畸变，而对照组为3.0±12.0%(P<01.46)。结构重排和染色体断裂主要影响含有免疫应答和细胞周期基因的条带。在六名患者中发现了马赛克核型。其中一个具有核型46，XX / 14，XX，r(<>)，其他人具有性染色体镶嵌。在这些情况下，产前诊断可能是必不可少的。结论是染色体畸变可能在ART手术反复失败中起作用。

1. 简介

辅助生殖技术(ART)，例如体外受精和胚胎移植(IVF-ET)，受精卵输卵管内移植(ZIFT)和宫内人工授精(IUI)，在自发或刺激周期中已成为某些形式的女性或男性不育症的有效治疗方法。然而，这些技术的怀孕率仍然相当低，尽管体外受精的卵母细胞比例很高。受精率和植入率之间存在这种差异的原因尚未阐明。

同样，我们对参加ART项目的患者的核型的了解相当有限。其原因尚不清楚，但可能是由于这些患者有输卵管病变，宫颈粘液功能障碍，多囊卵巢综合征或男性生育力低下，因此通常不接受细胞遗传学评估。为阐明染色体畸变在人类生殖失败中的可能作用而进行的一些调查表明，2-18.75%的男性和约15%的女性在不孕症诊所就诊时发生染色体重排。另一方面，表型正常个体可能携带淋体嵌合体，生殖细胞可能含有非整倍体系。此外，一些染色体异常可能表现出轻微的畸形，可能与妊娠相容。染色体异常是自然受孕或辅助生殖后自然流产的最重要原因之一，似乎与配子受精有关。人类未受精卵母细胞染色体异常的发生率差异很大，从11%到47.7%不等，并且在受精卵和植入前胚胎的细胞遗传学分析中发现了很高的染色体畸变率。

本研究旨在探讨淋巴细胞染色体异常对辅助生殖手术不成功的可能性。

2. 材料和方法

染色体检查是在15名先前接受过不成功的IVF / ET，ZIFT或IUI手术的女性的淋巴细胞培养物中进行的。ART患者年龄在28-37岁(平均值31.1±2.1)和输卵管因素，不明原因的不孕症或宫颈因素引起的生殖问题，而精液分析在正常范围内。他们都接受了采访，并在希腊塞萨洛尼基的试管婴儿中心“Geniki Kliniki”获得了医学和生殖史。所有患者以前至少三次未能怀孕，但有些女性接受了四到五次ART手术。在至少有一个专利管的三个案例中，进行了三次IUI尝试，当它们不成功时，应用ZIFT。

控制性卵巢过度刺激由人绝经期促性腺激素(HMG-Humegon，Organon，Oss，荷兰或Pergonal，Serono，瑞士)或通过黄体生成素释放激素(LHRH)激动剂(Bhereelin，Suprefact，Hoechst，德国美因河畔法兰克福，或Decapeptyl，Arvekap，Laboratoires Pharma Biotech，Signes，法国)联合HMG和人绒毛膜促性腺激素(HCG-Pregnyl，Organon或Profasi HP， Serono)，如前所述。在IVF或ZIFT的情况下，通过经阴道超声引导的卵母细胞采集进行取卵。使用精液制备、卵母细胞授精和胚胎培养以及宫内人工授精的标准程序。

对照组包括来自同一年龄组的26名健康个体，年龄在38-34岁(平均值，2.3±9.<>)，有两个正常的后代，已知具有正常的染色体补体，并且没有职业或医学暴露于潜在裂缝基因的既往史。

在72小时植物血凝素(PHA)刺激的外周血培养物中，通过标准方法制备所研究患者的有丝分裂染色体进行细胞遗传学分析。RPMI 1640(Gibco-BRL，Life Technologies，佩斯利，苏格兰，英国)使用l-谷氨酰胺和20%胎牛血清进行培养，并通过胰蛋白酶-吉姆萨绑带技术对染色体进行带状。总体而言，分析了来自12人的657 33中期，以确定结构和数字染色体畸变：来自5257名患者的15个细胞和来自7400名对照的18个细胞。为了增强我们对正常对照中核型变异的了解，我们研究了来自六个正常人的1000多个核型，而在其余对照中，分析了每个个体100个中期。在镶嵌的情况下，对每位患者进行三种淋巴细胞培养。所有细胞遗传学分析均在保加利亚索非亚医学遗传学系的细胞遗传学实验室进行，使用实验室自己的对照值。每张幻灯片都以盲法编码和检查。在显微镜下详细分析染色体。仅当染色单体轴存在不连续性时，才将消色染色体区域评分为断裂。估计每 100 个细胞的中断次数。当在显微镜下出现断裂或其他染色体畸变的视觉印象时，对有问题的细胞进行拍照和核型分析。基因的染色体分配和区域定位信息来自DNA委员会的报告[26]和存在相关疾病的位点的染色体基因列表。

3. 结果

在ART患者中，染色体畸变比对照组观察到的频率显着增加(分别为6.79±0.68%和1.72±0.3%;P<0.001)。然而，个体之间的发病率差异很大，从2%到18.02%不等，只有一名患者具有正常的染色体异常值(8%)。

与对照组(100.6±18.0%)相比，ART患者的染色体断裂频率(每65个细胞断裂)更高(1.42±0.27%);P<0.001)。然而，患者染色体断裂的发生率差异很大，从1.8%到16.67%不等(图2)。关于单个染色体上断点的分布，发现患者和对照组在着丝粒断裂表达方面存在显着差异(3.18±0.47 vs 0.26±0.12%;P<0.001)。在13名患者中，有15名患者的着丝粒断裂率增加，但其中11名(患者#12，#15和#9)的发生率极高(分别为13，1.7和14.0%)与对照组(P<001.1)。染色体断裂超过 0%(正常值：03.11%)的最不稳定条带见于患者 #1：11p13–p1 (2.12%)(具有促甲状腺激素-β (TSHβ))基因、11p1.12–p1.1 (11%)(甲状旁腺激素样激素 (PTHLH))和 Xq13–q1 (4.1%)(细胞周期 G1 (CCG12) 相位缺陷);患者#11：12q2(1%)(补体成分1(C5NH)抑制剂)，12p1(3.9%)(补体成分9(C6))，12p1(3.2%)(谷胱甘肽S-转移酶(GsT15));在患者#1中：11p13-p1(6.3%)(TSHB)，11q12-q1(谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX5))，12p1(6.9%)(C8)和11p2.1(6.<>%)(LHRH)。

4. 讨论

这是首次尝试研究染色体异常对辅助生殖技术效率低下的可能意义。

来自本研究的数据表明，在三次或更多次辅助生殖程序后未怀孕的患者的淋巴细胞结构畸变的频率显着增加。原因尚不清楚，但这些异常可能在ART失败中起作用。或者，有人认为超排卵药物可能会在卵母细胞中诱导高染色体异常率，尽管Bongso等人[28]无法证实这一假设。显然，需要更大规模的研究来阐明这个有趣的问题。

与对照组相比，ART治疗不成功的患者染色体断裂发生率极高。最重要的差异是在染色体着丝粒区域的断裂频率上发现的。这种着丝粒不稳定性显然不同于众所周知的过早着丝粒分裂(PCD)[29]。在我们的至少三名患者中观察到的着丝粒处的过度断裂可能会通过损害着丝粒与纺锤体纤维的附着而诱发减数分裂染色体异常，并可能导致配子携带额外或缺失的染色体。或者，染色体断裂的高频率可能会改变免疫反应和细胞周期以及激素(TSHB，PTHLH，LHRH)和酶(GST2，GPX1)的重要基因的功能。

我们研究的另一个有趣发现是，与对照组相比，ART患者的染色体畸变频率增加，发生在淋巴细胞培养物的单细胞中。我们在12名女性中确定了15名单细胞染色体畸变的患者，类似于Lange等人[2]，他们从38对随机选择的IVF / ET夫妇中发现了72名个体。独特的染色体异常在生殖衰竭中的作用尚不清楚。希金斯和帕尔默[30]认为，在习惯性流产患者中发现明显更多的独特易位可能反映了染色体的更大不稳定性。他们提出，在这些体细胞中看到的一些重排也发生在生殖系中，可能会损害人类的生育能力。

在我们的研究人群中，还对产生结构染色体畸变的108次断裂(ART患者的64次断裂和健康个体的44次断裂)进行了详细分析。ART患者中含有免疫应答和细胞周期基因的条带中断点的频率明显高于对照组。这意味着这些条带的结构重排可能与基因损伤有关，这对于辅助生殖失败可能很重要。

目前的细胞遗传学研究表明，多次尝试ART失败的患者中有很大一部分是染色体嵌合体的携带者(15次中有40次)。在我们的研究中观察到的频率(2%)高于Lange等人[17]，他们发现随机选择的IVF夫妇中有<>%有性染色体嵌合体或易位。这种差异可归因于我们的患者群体，该人群被专门选择为具有多次ART失败。在体细胞中看到的染色体重排似乎也可能发生在生殖细胞中，从而增加了异常后代或由于异常核型而导致的后续妊娠丢失的机会。

总之，在染色体畸变频率高、着丝粒区染色体断裂、染色体断裂和具有免疫反应基因、细胞周期或激素基因以及镶嵌核型的条带处发生结构重排的患者中，辅助生殖技术的效率较低。因此，在接受ART治疗的患者中发现的染色体异常可能在这些手术的反复失败中起作用。尽管需要进一步的研究来证实这一观点，但似乎有理由建议在ART患者的病情检查中包括染色体评估，特别是在两次或两次以上尝试失败的情况下。此外，对于怀孕的镶嵌核型夫妇，建议进行产前诊断以进行遗传咨询和进一步治疗。