参考文献：本文引用自“接受辅助生殖治疗的妇女卵泡液的BMI相关代谢组成及其对卵母细胞和胚胎质量的影响(BMI-related metabolic composition of the follicular fluid of women undergoing assisted reproductive treatment and the consequences for oocyte and embryo quality)”，作者是S.D.M. 瓦尔克克斯、I. 德保， 德纽堡、 I. 伊尼翁、 M·泊尔斯、 E.弗兰森、 P.E.J.博尔斯、 J.L.M.R. 勒鲁瓦。

一、介绍

肥胖与生殖失败的风险增加有关(Pasquali 等人，2007 年;Lash and Armstrong， 2009)，月经模式的变化，无排卵周期，受孕延迟和怀孕期间的多种并发症(Sebire等人，2001)。除了自然怀孕的几率较低外，肥胖也被证明会影响整体成功以及生育治疗的成本(Koning等人，2010)。尽管大多数与BMI相关的生育研究报告了BMI对生育治疗成功率的负面影响(Sebire等人，2001年;Fedorcsak等人，2004年)，有多个研究无法显示BMI对辅助生殖结果的影响(Lashen 等人，1999 年;德肖等人，2006年;马蒂努齐等人，2008年)。这一争议表明，肥胖或其他母体代谢紊乱对卵母细胞质量和生育结果的影响是复杂的，并且是多因素的。

超重和肥胖的妇女表现出血清代谢改变，导致高血清胆固醇和非酯化脂肪酸(NEFA)浓度，高血糖和胰岛素抵抗(Lebovitz，2006)。在动物模型中使用随着时间的推移重复取卵(OPU)，我们发现血清代谢变化反映在卵泡液中(Leroy等人，2004，2005)。 知道卵母细胞和胚胎都非常容易受到其微环境变化的影响(Gilchrist等人，2004;Leroy等人，2012)，最近的研究一直集中在接受辅助生殖治疗的妇女的卵泡微环境(ART;罗克等人，2009;荣海姆等人，2011 年)。这种微环境组成的改变可能会影响卵母细胞和卵丘细胞的质量(Leroy等人，2005;罗克等人，2009;荣海姆等人，2011)并可能反过来阻碍胚胎生理学，例如，通过葡萄糖耐受不良和植入前胚胎中基因表达模式的改变来表征，可能导致植入率降低和随后的发育异常(Robker，2008;布鲁尔和巴伦，2010年;范霍克等人，2011 年)。然而，只有少数研究关注代谢重要血清参数的这种差异如何反映在卵泡液中，以及这可能如何影响正常、超重和肥胖女性的卵母细胞发育能力。因此，我们假设接受ART的女性血清中的代谢变化反映在排卵前卵泡的卵泡液中，并且这种代谢变化会影响卵母细胞的发育能力。我们选择将BMI作为一个分组变量进行研究，因为它已知参与代谢紊乱及其在低生育力中的潜在作用。本研究的具体目的是：研究接受IVF治疗的女性的血液代谢谱是否反映在卵泡液中，(ii)调查母体BMI是否与卵泡液代谢物浓度有关，以及探索卵泡液的代谢组成是否以BMI依赖的方式影响生育治疗结果参数。

二、材料和方法

1.患者和试管婴儿数据

这项研究得到了安特卫普大学伦理委员会(UA A09-04)和安特卫普ZNA Middelheim医院(EC 3352)的批准。在抽样期间，每个寻求辅助生殖服务的患者都被要求参加研究。选择进入研究的患者签署了知情同意书。参与的妇女(n = 106)接受长激动剂方案治疗，其中使用Busereline鼻喷雾剂(Suprefact，赛诺菲-安万特，法兰克福，德国)开始脱敏。滤泡刺激由hMG(Menopur，Ferring Pharmaceuticals，哥本哈根，丹麦)或rFSH(Gonal-F，Merck Serono，日内瓦，瑞士或Puregon，MSD，Oss，荷兰)诱导。当三个或更多卵泡达到≥18毫米直径时，施用hCG(孕基，MSD)。经阴道，超声引导的卵母细胞取出在37小时后进行。使用Van Royen等人描述的标准IVF / ICSI程序。(1999). 简而言之，卵母细胞在第 0 天通过授精或 ICSI 受精。在第1天，评估卵母细胞是否存在两个原核(2PN)。胚胎的评估和分级基于对细胞裂解、细胞碎裂和多核卵裂球存在的形态学评估。优质胚胎被定义为具有(i)第2天有3或20个卵裂球，第3天有1999个或更多卵裂球的胚胎;(ii)第3天碎裂或更少，从未多核卵裂球(Van Royen等人。所有胚胎移植均在进行。

患者的身高(cm)和体重(kg)用于计算BMI评分。而正常体重定义为 18.5 ≤BMI ≤24.9 公斤/米2超重为 25.0 ≤BMI ≤29.9 公斤/米2，当 BMI 超过 30 kg/m 时，患者被视为肥胖2 (世卫组织，2011年)。体重不足(BMI <18.50)患者被排除在研究之外。患者特定数据包括年龄(岁)、试管婴儿尝试次数、使用的促性腺激素(IU)剂量、女性不孕症(多囊卵巢综合征或PCOS、子宫内膜异位症、免疫功能低下生育力、输卵管腹膜和输卵管异常)和男性不育(偶氮阻塞性、男科和免疫性不育)或特发性不育的原因。进一步揭示的患者特异性数据：hCG给药当天的血清雌二醇(E2)浓度，回收的卵母细胞总数，IVF或ICSI后的受精卵母细胞数量(2PN的受精卵数量)，胚胎总数，高质量胚胎总数，移植胚胎数量，生育治疗结果(无受孕，生化妊娠，临床流产，足月妊娠)和出生日期。基于这些数据，我们定义了不同的参数作为卵母细胞质量的标志物。这些包括受精率(2PN的数量/卵母细胞的数量)，胚胎的百分比(胚胎数量/卵母细胞的数量)，高质量胚胎的百分比(顶级胚胎的数量/卵母细胞的数量)，受精后胚胎的百分比(胚胎数量/2PN的数量)和受精后高质量胚胎的百分比(高质量胚胎的数量/2PN的数量)。

2.血液和滤泡液的取样和生化分析

在取卵过程中收集最大的，第一个穿刺卵泡的卵泡液(经阴道滤泡抽吸)。虽然大多数>15毫米的窦卵泡被刺穿，但该研究仅包括单个卵泡≥18毫米。仅使用不含血液和冲洗介质的抽吸物进行分析。在OPU之后直接采集两份血液样本，用于提取血清(含凝血激活剂的血清凝胶，比利时埃森Sarstedt Monovette)和血浆(用氟化物测定葡萄糖，Sarstedt Monovette)。所有样品均保持在4°C，并在融化的冰上运送到实验室。将卵泡液(1500g，10分钟)和血液样品(1400g，30分钟)离心(Sigma 2-16，Qlab，Vilvoorde，比利时)，随后，上清液在采样后2小时内等分。所有样品均在-80°C下储存，直至分析标准生化参数[尿素、总蛋白、白蛋白和C反应蛋白(CRP)]、脂肪代谢中涉及的参数[胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇、甘油三酯(TG)、NEFAs、载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白B(ApoB)、总肉碱和游离肉碱]、碳水化合物代谢参数(葡萄糖和乳酸)以及重要激素和相关参数[胰岛素， 胰岛素样生长因子1(IGF-1)，IGF结合蛋白3(IGFBP3，仅在卵泡液样品上)]。血清葡萄糖，胰岛素和NEFA浓度用于计算定量胰岛素敏感性检查指数(QUICKI)和修订的QUICKI(rQUICKI)，它们表明胰岛素敏感性的程度(Perseghin等人，2001)。

I 0是血清胰岛素值(mU/l)，G 0是血清葡萄糖值(mg/dl)，NEFA 0是血清游离脂肪酸浓度(mmol/l)。

测定内部和检测之间的变化分别在括号中以百分比表示。根据制造商的说明，使用模块化P系统(罗氏诊断)测定尿素(1.7，2.2)，总蛋白(0.7，2.3)，白蛋白(0.9，2.4)，胆固醇(1.1，1.4)，高密度脂蛋白胆固醇(1.9，3.8)，TG(1.3，2.3)，葡萄糖(1.1，1.3)，乳酸(1.8，1.9)，ApoA1(0.9，2.9)和ApoB(1.0，3.5)浓度。NEFAs(2.5，4.9)，总肉碱(2.4，3.5)和游离肉碱(3.0，4.4)使用RX Daytona(Randox实验室)测量。放射免疫测定试剂盒用于测量胰岛素(2.1，6.5)，IGF-1(9.8，10.4)和IGFBP3(4.0，5.6)浓度(分别为生物源和诊断系统实验室和Diasource)。高灵敏度CRP(3.1，5.9)测量通过BNII(西门子诊断)的免疫浊度法进行。

3.统计分析

所有统计分析均使用 PASW 统计 18(适用于 Windows，芝加哥，伊利诺伊州，美国)或 R 2.13.1(www.r-project.org，最后访问时间为 27 年 2012 月 2002 日)。进行了几次统计假设检验，以研究患者信息与生殖结果参数之间的关系，统计检验的类型取决于结果参数的性质。使用卡方检验测试ICSI / IVF对最终妊娠成功的影响。t检验用于调查接受IVF治疗的患者组与接受ICSI治疗的患者组的BMI是否不同。使用准泊松回归分析计数的数字，如Agresti(2003)描述的F检验。使用线性回归分析数值变量，使用逻辑回归分析二进制结果。通过Kruskal-Wasllis测试，移植的胚胎数量与BMI相关。

通过Spearman相关分析计算卵泡液和血清值之间的成对相关系数。基于线性回归确定(i)卵泡液和血清代谢物与BMI和(ii)卵泡液代谢物和生育结果参数之间的关联。线性判别分析(LDA)和逻辑回归分析用于研究与女性不孕症病因相关的血清和卵泡液参数的差异。首先，使用所有卵泡液或血清化合物作为预测因子，并将病因作为结果进行LDA。执行了LDA的稳健形式，如Venables和Ripley(0)所述。该LDA进行了多次运行，每次都对比一种病因与所有其他病因的组合。使用LD函数中化合物的负载对单个化合物在预测病因方面的重要性进行评分。

随后，对于具有最高载荷的参数，以参数作为输入变量，并将不孕病因的隶属关系作为结果进行逻辑回归。这种回归是针对每个不孕症原因单独进行的。对于这些分析，只有男性不孕症原因的夫妇的女性被认为是“正常的”，而不是“特发性的”。唯一一对具有不孕症免疫学原因的夫妇被排除在外，因为缺乏一项观察的统计功效。卵泡液和血清参数作为SD±平均值。如果卵泡液或血清参数不呈正态分布，则对对数变换参数进行回归。统计学显著性的阈值设定为P < 05.<>。

三、结果

研究人群

BMI组间患者平均年龄(n=106)无差异(表I)。患者信息显示，56.6%的女性体重正常，24.5%超重，18.9%肥胖。体重与BMI显著相关(r = 0.911，P<0.01)，但与身高无关。QUICKI (P < 0.01) 和 rQUICKI (P < 0.01) 值随着 BMI 的升高而下降，表明超重和肥胖组发生胰岛素抵抗的机会更大。生育治疗的原因是13.2%的夫妇女性生育力低下，51.9%的夫妇男性不育，16.0%的夫妇男性/女性不育。共有18.9%的夫妇患有不明原因的不孕症。

BMI增加与男性或女性的低生育能力迹象无关。IVF和ICSI治疗之间的成功率没有差异，BMI等级之间IVF / ICSI的使用也没有统计学上的显着差异。BMI组之间移植的平均胚胎数量没有显着差异。线性回归显示，IVF尝试次数随着BMI的增加而增加(P < 0.01)。此外，促性腺激素剂量随着BMI的增加而增加(P < 0.01)。

四、讨论

在本研究中，我们调查了超重和肥胖女性血液成分的改变是否反映在卵泡液中，以及这是否会损害卵母细胞的发育能力、随后的胚胎质量和怀孕率。我们发现，随着BMI的增加，获得的卵母细胞明显减少，虽然没有统计学意义，但受精卵母细胞(2PN)往往发育成形态学顶级胚胎的机会减少。这与所分析参数的卵泡液浓度的BMI相关差异无关。然而，我们发现，无论BMI如何，患者之间血清参数的差异部分反映在卵泡液中，卵泡液ApoA1和卵泡液总蛋白分别与卵母细胞发育成高质量胚胎的机会和形成的胚胎数量呈负相关。

与先前的发现一致，我们的数据显示肥胖女性的峰值E2水平较低(Lashen 等人，1999 年;Dechaud等人，2006)，抽吸的卵母细胞数量较少，源自这些卵母细胞的胚胎数量较少(Metwally等人，2007;罗克等人，2009 年)。然而，在这项研究中，肥胖和正常体重女性成功怀孕的机会没有显着差异。

众所周知，卵母细胞容易受到其微环境变化的影响，并且许多因素可能会影响其关键的最终成熟，从而导致发育能力的卵母细胞(Revelli等人，2009;勒罗伊等人，2012 年)。然而，尚不清楚卵泡液中与BMI相关的变化会在多大程度上影响卵母细胞质量。因此，我们选择研究血清和卵泡液中是否存在标准生化、脂肪代谢相关、碳水化合物代谢相关和激素参数。我们的分析表明，大多数卵泡液代谢物浓度(尿素、乳酸和肉碱除外)低于血清浓度，证实了血-滤泡液屏障的调节作用和/或卵母细胞、颗粒和卵丘细胞代谢的实质性贡献(Webb 等人，2004 年;罗杰斯和欧文-罗杰斯，2010)。

由于大多数血清和卵泡液代谢物浓度显着相关，我们得出结论，血清代谢物浓度部分反映在卵泡液中，可能直接影响卵丘-卵母细胞复合物(COC)的质量。然而，BMI的显着影响只能检测到卵泡液CRP，胰岛素，IGF-1和TG，显然这些参数都与我们研究中的任何生殖结果无关。无论BMI如何，卵泡液总蛋白的浓度都与胚胎数量有关，这与Iwata等人的发现一致。(2010)谁表明，来自总蛋白质卵泡液浓度较高且白蛋白浓度较低的奶牛的卵母细胞发育能力受损(Iwata等人，2010)。此外，我们的数据显示，血清总蛋白浓度的改变在卵泡液中被模拟，可能直接影响卵母细胞质量。

在早期胚胎发育过程中营养诱导的高胆固醇血症状况已被证明在细胞数量、凋亡细胞指数和代谢和发育重要基因的基因表达模式方面影响卵母细胞发育能力和胚胎质量(Leroy 等人，2010 年)，并可能导致生长迟缓(Picone 等人，2011 年).在我们的研究中，血清高密度脂蛋白胆固醇的BMI依赖性浓度与卵泡液浓度显着相关，表明卵泡液高密度脂蛋白胆固醇容易受到血清胆固醇变化的影响，因此可能影响COC质量。卵泡液ApoA1浓度与(i)“顶级胚胎数量/卵母细胞数量”和(ii)“顶级胚胎数量/2PN数量”(趋势)之比之间的负相关证实了这一点，这表明卵泡液中HDL颗粒数量的这种替代标志可能对卵母细胞的发育能力产生负面影响， 即使受精正常。有趣的是，有人提出，卵泡液HDL胆固醇和卵泡液ApoA1的综合作用通过减少胚胎碎裂在卵母细胞的健康和随后的胚胎发育中起着保护作用(Browne等人，2008)。

然而，布朗等人。(2008) 还表明卵泡液HDL胆固醇或卵泡液ApoA1的增加分别导致卵泡液ApoA1和卵泡液HDL胆固醇对胚胎分级的“保护”作用略有降低(Browne等人，2008)，这表明在我们的研究中HDL胆固醇/ApoA1比率的变化可能导致ApoA1对卵母细胞质量的负面影响。肉碱在血清和卵泡液样品之间显示出良好的相关性，卵泡液中的浓度最高。增加肉碱水平已被提出以增加β氧化和改善卵母细胞发育能力(Dunning等人，2011)。

我们的数据表明，血液中肉碱水平不足反映在卵泡液中，因此可能会损害卵母细胞质量。卵泡液中的肉碱也与最大E2值相关，表明肉碱在卵巢对促性腺激素刺激和卵母细胞成熟的反应中的作用。此外，这些高肉碱浓度具有抗氧化功能，可能保护COC免受由卵泡液中存在的其他参数引起的过量氧化应激(Dunning等人，2011)。后者得到了我们在不孕症病因与卵泡液化合物浓度之间的关联研究中提出的卵泡液化合物之间复杂的非线性相互作用的证实。

胰岛素在肥胖妇女的血清和卵泡液中均显示浓度升高，并且血清和卵泡液样本之间相关性良好。这与我们的(r)QUICKI数据一致，显示肥胖时胰岛素抵抗的机会更高。此外，患有输卵管不孕症和PCOS的女性表现为卵泡液胰岛素水平升高。胰岛素具有生长/抗凋亡作用，并具有增加COC中葡萄糖摄取的代谢能力(Purcell和Moley，2011)。它在各种细胞类型中发挥其作用，并参与卵泡单元内的多种(类固醇)途径，升高和降低的水平都可能改变卵母细胞的成熟和质量(Adamiak等人，2005;加恩斯沃西等人，2009;弗莱萨维耶维奇等人，2009年;桑切斯等人，2011 年)。血清和卵泡液样本之间的IGF-1浓度相关性良好，表明血清IGF-1浓度的变化在卵泡液中被模拟。有趣的是，卵泡液IGFBP3浓度与BMI无关，而IGF-1浓度与BMI无关(在血清和卵泡液中)。

卵泡液IGFBP的差异以及与当地产生的IGF-II的相互作用可能会影响IGF-I生物利用度，这与无排卵性卵巢病变的途径有关(Amato等人，1999;席尔瓦等人，2009 年)。此外，IGF-1影响卵母细胞的发育能力(Silva等人，2009)，例如在富含IGF-1的条件下培养的早期前窦小鼠卵泡产生卵母细胞，卵母细胞以更高的速率发育成具有更高细胞数量的囊胚(Demeestere等人，2004)。血清中尿素的浓度和卵泡液的相关性很好，这表明血液中尿素浓度升高直接反映在卵泡液中。因此，尿毒症条件可能直接影响卵母细胞的质量和随后囊胚的体外孵化(De Wit等人，2001;费雷拉等人，2011 年)。

血清和卵泡液CRP水平之间也存在很强的相关性，较高的BMI伴随着血清和卵泡液中CRP浓度的升高。卵泡液和血清CRP浓度升高以前与接受生育治疗的妇女的慢性无排卵和无孕有关(Levin等人，2007年;拉迈塔等人，2012 年)。如此高的CRP水平是炎症增加的特征(Das，2001)，并且被认为参与氧化应激和活性氧机制，这在有关卵母细胞发育能力和随后的胚胎质量的研究中都非常热门(Agarwal等人，2008;康贝尔斯等人，2009 年)。

出乎意料的是，我们发现BMI和BMI相关参数浓度与卵母细胞质量参数之间只有很小的显着相关性。例如，我们找不到生育治疗结果与血糖或NEFA浓度之间的显着关联。高血糖(Purcell和Moley，2011)和NEFA升高(Leroy等人，2005;荣海姆等人，2011;范霍克等人，2011)浓度以前与COC形态受损和卵母细胞发育能力受损有关。NEFAs在血清和卵泡液样本之间显着相关，被认为是超重和肥胖妇女生育力低下发病机制中有趣的代谢关键(Mu等人，2001)。此外，在我们实验室进行的研究模拟了牛体外成熟期间与高卵泡液NEFA条件相关的高溶脂条件，并发现源自这些暴露卵母细胞的囊胚具有较低的细胞计数，增加的凋亡细胞比例和关键代谢基因的基因表达谱改变(Leroy等人，2005;范霍克等人，2011 年)。

在我们的研究中，我们选择仅分析最大的，首先穿孔的卵泡的卵泡液的组成，以减少卵泡大小对卵泡液组成的混杂影响。在这样做的过程中，我们无法解释同一患者的卵泡之间的差异。这项研究的一个主要局限性是，每个BMI类别中招募的女性人数不同，扭曲了BMI分布，尽管是西欧地区标准人群的特征，但可能掩盖了重要的关联。其他研究人员选择平衡每组的患者数量(Robker等人，2009)，或者对BMI对整体妊娠结果的影响尚无定论，因为一些研究报告，例如，肥胖女性的胚胎比例较低，植入率降低和怀孕率降低，而其他研究(Lashen et al.， 1999年;Dechaud等人，2006)，包括我们自己的，无法证实这一点。此外，在本研究中，肥胖组的BMI扩散很低，因为首先建议极度肥胖的女性在开始ART之前减肥。然而，即使在我们的研究队列中，只有中度肥胖的女性，我们也确定了几个可能影响卵母细胞质量的滤泡液参数，与患者的BMI无关。因此，尽管我们的研究结果并不完全支持关于肥胖对ART负面影响的普遍看法，但我们相信，我们提供的数据对于研究决定卵母细胞质量的潜在途径是有用的。

五、结论

在这项研究中，我们描述了接受辅助生殖治疗的女性卵泡液中BMI相关代谢成分及其对卵母细胞和胚胎质量的影响以及接受辅助生殖的妇女的卵泡液和血清中代谢重要参数的存在，并且我们发现血清代谢物的变化部分反映在成熟卵母细胞的卵泡微环境中。卵泡液ApoA1和总蛋白质浓度与卵母细胞质量呈负相关，BMI的差异无法解释这一观察结果。我们的数据强调滤泡液中代谢畸变的参与，而不是与BMI相关的变化，因为对卵母细胞质量有潜在的危险影响。进一步研究导致代谢紊乱女性生殖结果不良的潜在机制将有助于确定特定的代谢条件，这些疾病使女性面临生殖性能差的风险。