近年来，不孕不育已经成为危害人类健康的重大疾病之一，它就像癌症一样，是一个随着工业化的不断发展引起环境、食品和水质等的污染对人类生活长期影响的结果。除了生殖系统器质性疾病外，不明确的有害物质是引起不孕，造成习惯性流产和胚胎缺陷的一个主要原因。在我国，不孕不育患者数近10年来发生了急速增长其比例己接近或达到生育年龄人口的15%。

随着胚胎植入前检测技术的发展，如聚合酶链反应(polymerasechain reaction, PC町、荧光原位杂交(fluorescencein situ hybridization, FISH)和微阵列(microaηay)等，研究人员观察到，来源于辅助生殖技术(ART)的人胚胎染色体异常比例非常高。

众所周知胚胎染色体的异常与女性的年龄有关，即随着年龄的增加而增加。而且有研究表明，这个比例在年轻患者中有明显上升的趋势。非整倍体胚胎主要来源于卵子，由于胚胎非整倍体的形成在年轻女性中间有增加的趋势，这就提醒人们其可能与生活环境的改变有很大的关系。

由于重金属可导致细胞氧化应激，而氧化应激不但可以降低细胞内抗氧化剂的含量，又是造成染色体异常分裂的一个主要原因。因此，卵子非整倍体的形成很有可能与卵子内活性氧的水平和抗氧化剂的含量有关。本研究通过小鼠喂服藕合重金属和抗过氧化物来探讨哺乳动物个体衰老与卵子老化之间的关系。

下面让我们和艾尼亚健康试管试管之家专家一起来了解一下抗氧化剂对小鼠卵母细胞老化延缓作用的研究所需要的材料与使用的方法。

一、材料与方法

1、实验动物与分组

192只刚断乳的3周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠，购自广东省医学实验动物中心。购回后的小鼠在广州医科大学动物中心SPF级饲养室同室分笼饲养，每日光照时间比为12h : 12 h，环境温度控制在23± 2 ·c，湿度40%～60%，自由采食和饮水。将小鼠随机分为4组，每组每个时间点12只：A组为重金属藕合剂组，在饮用水中添加0.3mmol/L的乙二肢四乙酸(EDTA, Sigma公司)和0.15mmol/L拧攘酸铀(Sigma公司);B组为抗氧化剂组，在饮用水中添加40mg/L 硫辛酸和100mg/L乙酷肉碱(GNC公司);c组为混合组，即在饮用水中同时添加重金属祸合剂和抗氧化剂;D组为正常空白对照组，即喂养普通饮用水;所有药物全都添加在饮用水中，饮用水为普通自来水经无菌过滤后直接饮用，分别饲养3个月、6个月、9个月、12个月，饲养结束后每组每个时间点随机选取12只小鼠进行卵子实验研究。

2、卵子收集

在各阶段的小鼠饲养结束后，将雌性C57小鼠于下午8: 00腹腔注射孕马血清(PMSG，宁波第二激素厂)10IU, 46~48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG，宁波第二激素厂)10町，在促排卵的过程中继续喂予相应的饮用水。12～13h后断颈推处死，打开腹腔，找出输卵管，分离血管及脂肪组织，剪取双侧输卵管，迅速将输卵管放入人输卵管培养液{HTF液，自配)中，用HTF清洗3次后在显微镜下用慑子撕开输卵管的膨大部将可看到的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)溢出，将COCs在盯F中洗2遍，用按1: 9比例稀释的透明质酸酶(Vitrolife公司)去除颗粒细胞获得Mu期裸卵，用盯F清洗3次后置于新的HTF液滴中并计算卵子数目，卵子放置在覆盖有矿物油(Sigma公司)40µν滴的HTF液体，在37℃、体积分数5%C02的潮湿气体培养箱中培养，等待检测。小鼠饲养到12个月这个年龄段时卵子数目较少，所以对12个月阶段的小鼠卵子统计数目，不做线粒体、纺锤体等其他实验。为减少个体差异，我们在每组的各个年龄段中随机抽取10只小鼠检测卵子的数目后计算平均值。

表 1 4个时间段各组的卵子数目G士s)(n=10)

Table 1 The number of oocytes in each group of four periods

组别Group3个月3months6个月6months9个月9months12个月12monthsP

A24.6 ± 1.6#15.8± 1.7*7.2 ±1.1*4.1±1.4<0.05

B24.4土0.9#20.3 ± 1.110.7 ± 1.1 5.6 ± 0.9 <0.05

C25.2 ± 1.3# 20.7± 1.410.2± 1.35.5 ± 1.2 <0.05

D20.1±1.915.6 ± 1.3*7.5±1.6*4.2±1.3<0.05

*: P<0.05，与同一时间段的B、C组比较compared with groups B, C in the same period

#: P<0.05，与同一时间段的D组比较compared with group D in the same period

3、成熟卵母细胞线粒体膜电位检漂IJ(JC-1)

使用线粒体膜电位检测试剂盒(Si伊a公司，按试剂盒要求操作，取适量200×JC-1储存液、染色缓冲液与纯水按照试剂盒说明稀释成1×染色缓冲工作液，混匀井置于37℃水浴箱预热。吸取50µI 的l×染色缓冲工作液制成数个液滴，矿物油覆盖，置于37℃培养箱预热。每次将3～5只小鼠卵子混合，随后随机取15～20个Mu期卵子置于上述工作液液滴中，37·c、体积分数5%C02培养箱中孵育20--25 niin。卵子孵育结束后置于洗液中洗涤2～3次。荧光激光共聚焦倒置显微镜拍照保存，然后用ImageJ软件进行定量分析。

4、卵子纺锤体形态检查

(1)卵子固定

每组每个时间点随机取5只鼠的25个形态正常的Mu期卵子，体积分数4%多聚甲醒(Sigma公司)室温固定30min。然后转移到含体积分数0.5%Triton透膜液(含体积分数0,5%TritonX100的PBS溶液)的4孔板中。室温透膜20min后转移到封闭液，室温封闭，lh后将卵子放置于用封闭液稀释的α-Tublin抗体(Si伊a公司)中再室温避光孵育1.5h或4℃过夜。然后用洗脱液洗涤卵子3次，每次5mino将卵子置于载玻片上用Pl{Sigma公司)染核10min，尽量将卵子分散，以便于观察，盖上盖玻片，指甲油封片。封片后即可用荧光激光共聚焦倒置显微镜(Nikon-C2Si)观察分析并保存图片结果。

(2)纺锤体观察

正常情况下纺锤体呈梭形，两极有点状结构，呈红色的染色体规则排列在赤道板上，规则排列的绿色纺锤体微管将2个极点结构与赤道板上的染色体相连接。异常纺锤体表现为纺锤体长度缩短，部分或全部微管失去规则性或微管完全缺如。染色体排列异常表现为染色体排列在赤道板染色体区之外，或染色体分散存在，或有异常浅染的染色体。

5、统计学分析

统计学分析采用SPSS13.0软件进行分析，所得实验数据以均数±标准差σ土s)或百分率(%)表示，率的比较采用χ2检验，定量数据用单因素方差分析检验，P<0.05为差异有统计学意义。

已有大量的研究证明，生殖与发育缺陷中50%以上是化学物质和环境的影响所致，包括重金属类(如铅、锅、镇和铭等)和有机物(如二嗯英类、醒类和酣类)等。造成卵子染色体异常的原因和卵子内的信号通路及分子机理仍然不太清楚